蛋白鑒定的方法

蛋白鑒定的方法

1  圖象分析技術（Image analysis）

“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎的數據處理，進行定量分析。 在一系列高質量的2-DE凝膠產生（低背景染色，高度的重復性）的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數據庫構建。 首先，采集圖象通常所用的系統是電荷耦合CCD（charge coupled device）照相機；激光密度儀（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，對圖象進行數字化。 并成為以象素（pixels）為基礎的空間和網格。 其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意義的區域與背景分離，限定斑點的強度、面積、周長和方向。

蛋白鑒定的方法

圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致。 在這一原則下，多數系統以控制斑點的重心或高峰來分析，邊緣檢測的軟件可描述斑點外觀，并進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加度。 通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界。 以PC機為基礎的軟件Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為基礎的2-D分析軟件包。 第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化。 由于在2-DE中出現的重復性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對于圖象分析系統是一個挑戰。 IPG技術的出現已使斑點配比變得容易。 因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量算法在長度和平行度觀測。 用來配比的軟件系統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被采用，而神經網絡、子波變換和實用分析在未來可被采用。 配比通常由一個人操作，其手工設定大約50個突出的斑點作為“路標”，進行交叉配比。 之后，擴展至整個膠。

例如：的PI和MW（分子量）的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標準曲線來計算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象分析系統依據已知蛋白質的pI值產生PI網絡，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配。 所估計的度大大依賴于所建網格的結構及標本的類型。 已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0。25個單位。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數據庫中計算，利用產生的表觀分子量的網格來估計蛋白的分子量。 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯后蛋白的出入更大。 故需聯合其他的技術完成鑒定。

蛋白鑒定的方法

2  微量測序（microsequencing）

蛋白質的微量測序已成為蛋白質分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息。 盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜（PMF）可鑒定由2-DE分離的蛋白，但普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術。 目前已實現蛋白質微量測序的自動化。 首先使經凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然后直接置于測序儀中，可用于subpicomole水平的蛋白質的鑒定。 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產生；與質譜相比，Edman降解消耗大；試劑昂貴，每個氨基酸花費3～4$。 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分析成百上千的蛋白質。 然而，如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序。

近來，應用自動化的Edman降解可產生短的N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用于Edman降解，業已成為一種強有力的蛋白質鑒定。 當對Edman的硬件進行簡單改進，以迅速產生N-末端序列標簽達10～20個/d，序列檢簽將適于在較小的蛋白質組中進行鑒定。若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質。 選擇BLAST程序，可與數據庫相配比。 目前，采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用。

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